|
确定各种可能与目标蛋白相互作用的蛋白质，“撒大网”
l 双杂交和其他双成分系统
第一阶段：诱饵-LexA融合蛋白的鉴定
诱饵-LexA融合蛋白的构建
1．将编码诱饵蛋白的靶DNA克隆到LexA融合载体的多聚接头处，以合成一种框架内的LexA融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为pBait。
2．采用下列LexA融合基因和lexAop-lacZ报道质粒的组合，建立一系列EGY48 lexAop-LEU2选择的转化酵母菌：
a. pBait pMW12（活化测定）
b. pSH17-4 pMW12（活化的阳性对照）
c. pRFHM1 pMW12（活化的阴性对照）
d. pBait pJK101（抑制/DNA结合测定）
e. pRFHM1 pJK101（抑制的阳性对照）
f. pJK101单独（抑制的阴性对照）
3．将每种转化混合物铺在适宜的选择性缺陷板上：CM(Glu)-Ura-His（针对质粒组合a~e）或CM(Glu)-Ura（针对质粒组合f）。将培养板在37℃培养2~3天以选择含有质粒的转化酵母克隆。
4．制备转化子的母板。
活化和抑制活性的鉴定：X-gal和Leu2表型的分析
5．从a~f [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] 下一页
上一篇：基因组DNA Southern杂交 下一篇：与DNA结合蛋白相作用的启动子序列的鉴定 | 
