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  • 与DNA结合蛋白相作用的启动子序列的鉴定

  • 点击:    作者:   来源: 日期:2007-04-10    本站论坛

番茄子叶细胞核的分离提取为例子进行实验

步骤27须在4℃下使用高压灭菌过的设备进行。

1.将番茄种子种在灭菌的水饱和滤纸上,置于小盆内,用薄膜封口后,培养7天。用刀片切下番茄子叶后收集备用。

2.4050g新鲜组织放入300ml匀浆缓冲液,用韦林氏搅切器先1×4秒而后6×1秒。

3.过滤匀浆混合液,使其透过漏斗上的4层厚纱布及纱布下按孔径递减次序放置的3Nitex尼龙筛网(300μm100μm52μm),汇入大烧杯中。全部匀浆物均滤完后把纱布集中在一起,将纱布上的滤液压入尼龙网,并使其经漏斗流入烧杯中。切勿将滤液压出尼龙网,亦不可使用抽滤,让滤液靠重力作用下流。

4.将每批滤出的匀浆倒入500ml离心瓶中,用Sorvall GS3转头5000r/min4225g),4℃离心20分钟。

5.吸去上清,然后将核粗提沉淀物用大口径塑料巴斯德吸管温和地反复吹吸,使沉淀悬浮于匀浆缓冲液中。将重悬起的沉淀转入50ml离心管中,用匀浆缓冲液调节体积至约40ml

6.4℃用Sorvall SS34转头4000r/min1912g)离心10分钟,再次沉淀细胞核。重复步骤56三次,分别在3500r/min离心10分钟,8分钟和6分钟。最后一次离心后,尽可能洗净匀浆缓冲液。

7.将核悬浮于核悬浮缓冲液中,按每50g植物组织加0.5ml核悬浮缓冲液。用液氮冷冻,保存于-80℃。若核蛋白抽提即将进行,可不必将核冷冻起来。

核抽提物的制备

1.

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