几种主要分子生物学技术在菌物系统学研究中的应用
1、 核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一，现已广泛用于分子遗传学、基因工程及病毒学和细菌学等方面的研究。其理论基础是DNA变性－复性动力学原理，即具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等），可按碱基互补原则退火形成双链。核酸分子杂交的序列同源性主要以杂交百分率和杂交复合体的热稳定性来衡量。两种生物之间的亲缘关系越近，它们之间所共有的多核苷酸的相同序列就越多，即同源百分率越高。在真菌中，用整个基因进行的核酸分子杂交，除近似种外，其余的序列同源性都较低。因此，基因组杂交主要用于亲缘关系较近的种或种内不同分离物之间的鉴定。此外，有人还探讨了rDNA的杂交，如用互补序列DNA与25ＳrDNA杂交，用以研究担子菌和酵母之间的关系，用整个基因组DNA与克隆的rDNA杂交，用以研究真菌、藻和简单真核生物之间的关系。核酸分子杂交技术由于其分子杂交的高度特异性和检测方法的高度灵敏性，使得它被广泛用于基因克隆的筛选和酶切图谱制作、基因组中特定基因序列的定理和定性检测、基因突变分析以及疾病的诊断等方面。近年来该技术又与聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction , PCR）技术结合，成为对病原物不同属种及种以下单元进行鉴定诊断的一项有力工具。
2、 限制性片段长度多态性
限制性片段长度多态性（RFLP）是指用限制性内切酶消化不同个体的同源DNA分子，经电泳分离后表现的限制性片段长度差异。这种差异主要来源于基因突变和DNA分子结构重排所引，起的限制性内切酶识别位点的改变。目前，PFLP已广泛用于基因突变分析、基因定位和遗传病基因的早期检测等方面。
RFLP具有以下优点：（1）在多种生物的各类DNA中普通存在；（2）能稳定遗传，且杂合子呈共显性遗传；（3）只要有探针就可检测不同物种的同源DNA分子的RFLP成为一种十分重要的遗传标记。用随机克隆的DNA探针可以检测到一定水平的RFLP变异，这对于检测真菌种内及种间的变异是十分有用的。
在真菌分类学上RFLP主要用于DNA同源性比较，Tan等对小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)相关变种rDNA变异的研究，Anderson和Stasovski对密环菌属 (Armillaria)的分类等。
传统的DNA限制性片段长度多态性研究方法无论是核DNA、线粒体DNA、还是核糖体DNA，都有一个共同的局限性，即不仅需要大量相当纯的DNA样品，而且DNA杂交膜和探针的准备，以及杂交过程都相当耗时耗力，同时由于探针的异源性而引起的杂交低信噪比或杂交膜的背景信号太高等都会影响杂交的灵敏度。聚合酶链式反应（PCR）技术与RFLP方法的结合使用(常被称为PCR-RFLP)，恰好克服了上述缺点，实现了不需杂交和无需放射性标记的RFLP分析。同时由于PCR技术的引入，使人们可以按自己的目的随意针对生物体DNA的不同区段进行研究，酶切图谱也易于分析，这就使对生物体多态性的分析变得简捷快速。这一方法在真菌系统学的研究中占有相当的比重。
3、随机扩增多态性DNA
随机扩增多态性DNA(RAPD)技术是1990年由美国科学家J.G.R.Williams发展起来的。他将通常PCR反应中使用的两个特定序列的引物改为单一的由10个碱基构成的随机引物，并运用大量的不同序列的随机引物进行扩增，使基因组DNA多态性充分展现出来。由于RAPD技术允许在事先未知DNA序列的情况下检测基因组中存在的多态性，大大方便和拓宽了对基因组DNA变异的研究，而使这一技术一出现就首先被用于分子系统学研究中。另外，由于RAPD技术可以在一次反应中检测基因组的多个位点，能快速寻找两组或多组DNA样品间的多态性，并以此进行DNA分子水平的标记，从而使这一技术在病原菌群体遗传等方面几乎成为RFLP分析的替代手段，是抗病基因定位和遗传图谱构建的有力工具。
4、核酸序列分析方法
核酸序列分析方法是指通过测定核酸一级结构中核苷酸序列组成来比较同源分子之间相互关系的方法。核苷酸是生物体遗传信息的最基本组成单位，核苷酸序列能够为物种提供最丰富、最直接的信息。核酸序列分析用于研究生物分类和进化，可以克服杂交、RFLP分析等方法所遇到的局限性。大量的性状可直接观察到，如碱基变化的转化与颠换，不活动性与有选择性，核苷酸的变化趋势，这些变化在物种系统发育分析时都可以以不同的方式表现出来；公开发表的序列都可直接用来进行所需要的比较和分析。这就大大拓宽了我们的研究范围，可以在更广的范围上进行生物进化和系统发育的研究。
较早测定的是rRNA的序列，对rRNA序列的直接测序法大大促进了RNA序列在系统学研究中的应用。Sogin et al.通过对克隆获得的rRNA序列比较，在较广的范围研究了生物的系统发育。但是对RNA的测序是单链测定，无对应链校正，序列错误相对较多，一些生物的RNA序列转录后经过了修饰，不能确切反映基因中DNA的序列。PCR产物的直接测序克服了上述缺点。而PCR反应所用模板DNA量极少，包括从干标本中获得，从单个孢子中获得，甚至可以从灭绝的生物中获得。
PCR 产物也可以进行克隆以后再测序，克隆可以避免在每次需要扩增产物时都得重复进行PCR反应，这对模板的来源受到限制或由于片段长度等原因，使 PCR产物难以获得时尤其重要。将 PCR 产物克隆到载体上，也为其以后用作探针或在PCR实验中用作阳性对照带来了方便。
核酸序列测定是现代分子生物学中一项难度较大而重要的尖端技术。早在1965年，Holey用经典方法测出酵母丙氨 酸tRNA的75个核苷酸顺序，同年Sanger提出了测定小亚基rRNA序列的指纹图谱法。1975年Sanger又提出了测定DNA序列的加减法。1977年，Maxam和Gilbert发明了化学直接法，同年Sanger创立了双脱氧核苷酸(ddNTP)链终止法。后来Messing等组建了一系列的噬菌体M13载体系统，为ddNTP链终止法提供了天然模板和万能引物，使该法成为DNA测序的最好方法。
目前，菌物系统学中的序列研究几乎都集中在rRNA基因上，因为rDNA、mtDNA存在着广泛的保守区域，可以用作引物的结合位点，同时客观存在的不同区域进化水平不同，可以用于不同分类等级的研究。用于扩增rDNA、mtDNA不同区域的保守引物已有人设计成功，并广泛用于菌物系统发育研究中。最早用于系统研究的 rRNA基因是5S rRNA基因，Walker and Doolittle通过对8种担子菌的研究揭示了序列相似性类群之间的相互关系。Huysmane et al.获得了伞菌属(Agaricus)和木耳属(Auricularia)的3个种的5S rRNA基因序列，并将其与82个已发表的5S rRNA序列进行聚类分析，结果表明：真菌界是一个多系的类群。但是后来5S rRNA基因由于其长度大小和进化太快，被证明不适用于比较大多数真菌的系统学关系。
18S rRNA和25S rRNA因其长度较长（分别约为1800bp和3200bp）含有更多的信息，目前已广泛用于菌物系统学研究。如Gunderson et al.用 18SrRNA序列进行分析，结果表明：金 藻(Chrysophytes)和卵菌(Oomycetes)的关系较近。Sogin et al.研究了脉胞菌(Neurospora)与其它真核生物之间的关系。Hendriks et al.研究了担子菌白冬孢酵母属(Leucosporidium)的17S rRNA；Hibbett er al.对伞菌和腹菌的研究，以及Castlebury和Domier，Silva-Hanlin和 Hanlin等的研究，都有是利用小亚基rRNA进行的有关菌物系统学方面的研究。此外，小亚基rRNA序列还被广泛用于研究生物主要类群之间的关系，如Field et al.关于动物的研究，Woese关于细菌进化的研究， Woese et al.和Sogin et al.关于生物所有界级关系的研究。25S rRNA因其序列太长，目前只有少数几个测得了其完整序列，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，粘菌中的多头绒泡菌(Physarun polycephalum)。因此，人们主要用25S rRNA的部分序列进行系统发育学研究，如Guadet et al.对镰刀菌(Fusarium)的研究，Bruns et al.用线粒体大亚基 rRNA序列分析牛肝菌目(Boletales)的关系。5.8S rRNA及其两端的ITS序列，因为其进化速度快而主要用于研究低级分类单元的关系，如Lee and Taylor对疫霉属(Phytophthora)种间关系的研究，Gardes et al.对蜡蘑属(Laccaria)4个种的研究，以及Yao et al.对干酪菌(Tyromyces s.l.)系统学的研究，Skouboe et al.对青霉属(Penicillium)的研究，Cooke et al.对栎疫霉(Phytophthoraquercina)种的鉴定等等。
5、脉冲电场凝胶电泳
脉冲电场凝胶电脉（Pulsed Field Electrophoresis,PFGE）技术是20世纪80年代中期发展起来的一种新的电泳技术。它可以用于大分子DNA的分离，其分辨范围达到10Mb。而普通的琼脂糖凝胶电泳仅能分离小于50kb的DNA分子。PFGE的基本原理是通过电场的不断改变，使包埋在琼脂糖凝胶中的DNA分子的泳动方向做相应改变，小的DNA分子比大的变形快，故小分子泳动得快，从而在凝胶上按染色体大小而呈现出电泳带型，即电泳核型（Electrophoretic Karytype）。核型分析得到的DNA带数可以被近似地认为是真菌核内最少具有的染色体数，DNA带的密度也从一定水平上反映了核内DNA的含量以及DNA分子的大小。目前，脉冲电场凝胶电泳得到的核型图谱已广泛用于酵母和其它真菌的分类学研究中。
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