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cDNA文库组标准流程

点击： 作者：51protocol收集 来源： 时间： 2007-05-28 　本站论坛

cDNA文库组标准流程

一. Total RNA的提取 1
二. mRNA的分离 6
三．cDNA双链合成 8
四．载体制备 11
五. cDNA双链和载体的连接 14
六．电转化流程 15
七．快速鉴定、菌落PCR 17
八．pBlueScript cDNA库扩增 19

一.Total RNA的提取
1.试剂配制
准备工作：
1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。
2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃ 20mins 高压灭菌。
3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。
4、常用试剂及其配方：
▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。
▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5
三水合柠檬酸纳 22.94g
加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

▲10%肌氨酸钠：
肌氨酸钠 10g
加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

▲变性裂解液：
0.78M柠檬酸钠 8.25ml
10%肌氨酸钠 12.375ml
异硫氰酸胍 118.05g
加DEPC水定容至 250ml，室温放置备用
临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）

▲ 2M 醋酸钠 PH=4.5
NaAc

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