猪萎缩性鼻炎诊断技术
猪萎缩性鼻炎是猪的重要疫病，无法治疗和终生危害，是集约养猪业的大敌，世界动物卫生组织[World Organization for Animal Health(英)，Office Intentional des Epizootic(法)，OIE]和我国将之列为B类或二类动物疫病。
OIE《诊断试验和疫苗标准手册》(2000)(Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines ，2000)第2.6.1章规定了诊断该病的技术框架(未规定技术细节)。本标准与该章异同在于：
——本标准采用了该章规定的主要技术，但未完全采用某些推荐技术(如酶联免疫吸附试验(ELISA)和禽幼红细胞(EBL)细胞覆层琼脂法等)，并充分反映了本国的多年研究成果和经验；
——本标准依据《诊断试验和疫苗标准手册》的技术框架，规定了具体的操作程序。
本标准的附录B、附录C为规范性附录，附录A为资料性附录。
本标准由农业部畜牧兽医局提出。
本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。
本标准主要起草人:彭发泉、杨旭夫、苑士祥。
1范围
本标准规定了猪传染性萎缩性鼻炎的诊断技术。
本标准适用于猪传染性萎缩性鼻炎的诊断、检疫和对无特定病原(SPF)猪的监控。
2诊断方法
2.1临床检查
2.1.1对仔猪群应检查下列症状:有一定数目的仔猪流鼻汁、流泪，经常喷嚏、鼻塞或咳嗽，但无热，个别鼻汁混有血液。一些仔猪发育迟滞，犬齿部位的上唇侧方肿胀。
2.1.2对育成猪群和成猪群应检查:
a)鼻塞，不能长时间将鼻端留在粉料中采食；衄血，饲槽沿染有血液；
b)两侧内眼角下方颊部形成"泪斑"；
c)鼻部和颜面有如下变形:
1)上颚短缩，前齿咬合不齐(评定标准:下中切齿在上中切齿之后为阴性，反之为阳性)；
2)鼻端向一侧弯曲或鼻部向一侧歪斜；
3)鼻背部横皱褶逐渐增加；
4)眼上缘水平上的鼻梁变平变宽。
d)伴有生长欠佳。
2.1.3检疫猪群发现有上列症候群，可以临床上初步诊断猪群有支气管败血波氏杆菌I相菌的传染或与产毒素性多杀巴氏杆菌的混合感染，特别是2.1.2c)具有本病临床指征意义，需进行检菌、血清学试验及病理解剖检查，予以确诊。
2.2病理检查
2.2.1尸体外观检查
主要检查有无鼻部和颜面变形及发育迟顿，记录其状态和程度。对上颚短缩可以作定性，下中切齿在上中切齿之后判为"-"，反之判定为" "；测量上与下中切齿的离开程度，如-3mm或 12mm分别判定为正常或阳性。
2.2.2鼻部横断检查
2.2.2.1检查鼻腔是在鼻部作1～3个横断，检查横断面。鼻部的标准横断面在上颚第二前臼齿的前缘，此处鼻甲骨卷曲发育最充分。先除去术部皮肉，然后用锐利的细齿手锯或钢锯以垂直方向横断鼻部。可再向前(通过上颚犬齿)或向后作第2和第3新的横断，其距离大猪为1.5cm～2cm，哺乳仔猪约0.5cm
2.2.2.2为便于检查断面，先用脱脂棉轻轻除去锯屑。如果拍照，应将鼻道内的凝血块等除去，使断面构造清晰完整，必要时可用吸水纸吸除液体。
2.2.2.3首先检查鼻道内的分泌物的性状和数量及粘膜的变化(水肿、发炎、出血、腐烂等)。
2.2.2.4主要检查鼻甲骨、鼻中隔和鼻腔周围骨的对称性、完整性、形态和质地(变形、骨质软化或疏松、萎缩以至消失)以及两侧鼻腔的容积。如果需要，可以测量鼻中隔的倾斜或弯曲程度，鼻腔纵径及两侧鼻腔的最大横径。除肉眼检查外，应对鼻甲骨进行触诊，以确定卷曲及其基础部的骨板的质地(正常骨板坚硬，萎缩者软化以至消失)。鼻甲骨萎缩主要发生于下鼻甲骨，特别是腹卷曲。鼻腔标准横断面的萎缩性鼻炎分级标准见附录A。
2.2.3肺部检查
少数病仔猪伴有波氏杆菌性支气管肺炎。肺炎区主要散在于肺前叶及后叶的腹面部分，特别是肺门部附近，也可能散在于肺的背面部分。病变呈斑块状或条状发生。急性死亡病例均为红色肺炎灶。
2.2.4判定
具有鼻甲骨萎缩病变的病猪不论有或无临床鼻部弯曲等颜面变形症状，均判定为萎缩性鼻炎病猪。
2.3细菌检查
由猪鼻腔采取鼻粘液，同时进行支气管败血波氏杆菌I相菌及产毒素性多杀巴氏杆菌的分离。猪群检疫以4～16周龄特别是4～8周龄猪的检菌率最高。
2.3.1鼻粘液的采取
2.3.1.1由两侧鼻腔采取鼻粘液，可用一根棉头拭子同时采取两侧鼻粘液，或每侧鼻粘液分别用一根棉头拭子采取。
2.3.1.2拭子的长度和粗细视猪的大小而定，应光滑可弯曲，由竹皮等材料削成，前部钝圆，缠包脱脂棉，装入容器，高压灭菌。
2.3.1.3小猪可仰卧保定，大猪用鼻拧子保定。用拧去多余酒精的酒精棉先将鼻孔内缘清拭，然后清拭鼻孔周围。
2.3.1.4拭子插入鼻孔后，先通过前庭弯曲部，然后直达鼻道中部，旋转拭子将鼻分泌物取出，将拭子插入灭菌空试管中(不要贴壁推进)，用试管棉塞将拭子杆上端固定。
2.3.1.5夏天不能立即涂抹培养基时，应将拭子试管立即放入冰箱或冰瓶内。鼻粘液应在当天(最好在几小时内)涂抹培养基，拭子仍保存于4℃冰箱以备复检。
2.3.1.6采取鼻汁时病猪往往喷嚏，术者应注意手的消毒，防止材料交叉污染。
2.31.7解剖猪时，应同时采取鼻腔后部(至筛板前壁)和气管的分泌物及肺组织进行培养。鼻锯开术部及鼻锯应火焰消毒，由鼻断端插入拭子直达筛板，采取两侧鼻腔后部的分泌物。由声门插入拭子达气管下部，在气管壁旋转拭子取出气管上下部的分泌物。在肺门部采取肺组织，如有肺炎并在病变部采取组织块；也可以用拭子插入肺断面采取肺汁和破碎组织。
2.3.2分离培养
2.3.2.1培养基制备
血红素呋喃唑酮改良麦康凯琼脂(HFMA)，新霉素洁霉素血液马丁琼脂(NLHMA)，绵羊血改良鲍姜氏琼脂，三糖铁脲半固体高层培养基，配制方法见附录B。
2.3.2.2操作
所有病料都直接涂抹在已干燥的分离平板上。分离支气管败血波氏杆菌使用血红素呋喃唑酮改良麦康凯琼脂(HFMA)平板(见第B.1章)，分离多杀巴氏杆菌使用新霉素洁霉素血液马丁琼脂(NLHMA)平板(见第B.2章)。应尽量将棉拭子的全部分泌物浓厚涂抹于平板表面，将组织块的各断面同样浓厚涂抹。重要的检疫，如种猪检疫，对每份鼻腔病料应涂抹每种分离平板2个。不同种分离平板不能混涂同一拭子(因抑菌剂不同)。对伴有肠道感染(腹泻)的或环境严重污染的猪群，每份鼻腔病料可用一个平板作浓厚涂抹，另一个平板作划线接种，即先将棉拭子病料在平板的一角作浓厚涂抹，然后以铂圈作划线稀释接种。
2.3.2.2.1猪支气管败血波氏杆菌的分离培养
将接种的HFMA平板于37℃培养40h～72h，猪支气管败血波氏杆菌菌落不变红，直径约1mm～2mm左右，圆整、光滑、隆起、透明，略呈茶色，较大的菌落中心较厚呈茶黄色，对光观察呈浅蓝色。用支气管败血波氏杆菌O-K抗血清作活菌平板凝集反应呈迅速的典型凝集。有些样品菌落粘稠或干韧，在玻片上不能做成均匀菌液，须移植一代才能正常进行活菌平板凝集试验。未发现典型菌落时，对所有可疑菌落，均需作活菌平板凝集试验，以防遗漏。如菌落小，可移植增菌后进行检查。如平板上有大肠杆菌类细菌(变红、粉红或不变红)或绿版杆菌类细菌(产生或不产生绿色素但不变红)覆盖，应将冰箱保存的棉拭子再进行较稀的涂抹或划线培养检查，或重新采取鼻汁培养检查。
2.3.2.2.2产毒素性多杀巴氏杆菌的分离培养
将接种的NLHMA平板于37℃培养18h～24h，根据菌落形态和荧光结构，挑取可疑菌落移植鉴定。多杀巴氏杆菌菌落直径约1mm～2mm，圆整、光滑、隆起、透明，菌落或呈粘液状融合；对光观察有明显荧光；以45℃折射光线于暗室内在实体显微镜下扩大约10倍观察，呈特征的桔红或灰红色光泽，结构均质，即Fo荧光型或Fo类似菌落。间有变异型菌落，光泽变浅或无光泽，有粗纹或结构发粗，或夹有浅色分化扇状区等。
平板目的菌菌落计数分级见附录C。
2.3.3分离物的特性鉴定
2.3.3.1猪支气管败血波氏杆菌分离物的特性鉴定
2.3.3.1.1一般特性鉴定
革兰氏阴性小杆菌。氧化和发酵(O/F)试验阴性，即非氧化非发酵严格好氧菌。具有以下生化特性(一般37℃培养3d～5d记录最后结果):
a)糖管:包括乳糖、葡萄糖、蔗糖在内的所有糖类不氧化不发酵(不产酸、不产气)，迅速分解蛋白胨明显产碱，液面有厚菌膜。
b)吲哚试验阴性。
c)不产生硫化氢或轻微产生。
d)甲基红(MR)试验及维培(VP)试验均阴性。
e)还原硝酸盐。
f)分解尿素及利用枸橼酸，均呈明显的阳性反应。
g)不液化明胶。
h)石蕊牛乳产碱不消化。
i)有运动性，在半固体平板表面呈明显的膜状扩散生长，扩散膜边沿比较光滑；但0.05%～0.1%琼脂半固体高层穿刺37℃培养，只在表面或表层生长，不呈扩散生长。
2.3.3.1.2菌相鉴定
将分离平板上的典型单个菌落划种于绵羊血改良鲍姜氏琼脂(见第B.4章)平板(凝结水己干燥)上，置37℃潮湿温箱中培养40h～45h按下列要求分相:
a)I相菌落小，光滑，乳白色，不透明，边沿整齐，隆起呈半圆形或珠状，钩取时质地致密柔软，易制成均匀菌液。菌落周围有明显的?溶血环。菌体呈整齐的革兰氏阴性球杆状或球状。活菌玻片凝集定相试验，对K抗血清呈迅速的典型凝集，对O抗血清完全不凝集。I相菌感染病例在平板上，应不出现中间相和Ⅲ相菌落。
b)Ⅲ相菌落扁平，光滑，透明度大，呈灰白色，比I相菌落大数倍，质地较稀软，不溶血，活菌玻片凝集定相试验，对O抗血清呈明显凝集，对K抗血清完全不凝集。
c)中间相菌落形态在I及Ⅲ相之间，对K及O抗血清都凝集。中间相及Ⅲ相菌，以杆状为主。
2.3.3.2产毒素性多杀巴氏杆菌分离物的特性鉴定
2.3.3.2.1一般特性鉴定
2.3.3.2.1.1革兰氏阴性小杆菌，呈两极染色。不溶血，无运动性。具有以下生化特性:
a)糖管:对蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露醇及果糖产酸，对乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖及杨苷不产酸。
b)VP、MR、尿素酶、枸橼酸盐利用、明胶液化、石蕊牛乳均为阴性。
c)不产生硫化氢。
d)硝酸还原及吲哚试验均为阳性。
2.3.3.2.1.2对分离平板上的可疑菌落，也可先根据三糖铁脲半固体高层(见第B.3章)小管穿刺生长特点进行筛检。将单个菌落以接种针由斜面中心直插入底层，轻轻由原位抽出，再在斜面上轻轻涂抹，37℃斜放培养18h。多杀巴氏杆菌生长特点:
a)沿穿刺线呈不扩散生长，高层变桔黄色；
b)斜面呈薄苔生长，变桔红或桔红黄色；
c)凝结水变桔红色，轻浊生长，无菌膜；
d)不产气、不变黑。
2.3.3.2.2皮肤坏死毒素产生能力检查
体重350g～400g健康豚鼠，背部两侧注射部剪毛(注意不要损伤皮肤)，使用lmL注射器及4号～6号针头，皮内注射分离株马丁肉汤37℃ 36h(或36h～72h)培养物0.1mL。注射点距背中线1.5cm，各注射点相距2cm以上。设阳性及阴性参考菌株和同批马丁肉汤注射点为对照，并在大腿内侧肌注硫酸庆大霉素4万单位(lmL)。注射后24h、48h及72h观察并测量注射点皮肤红肿及坏死区的大小。坏死区直径1.0cm左右为皮肤坏死毒素产生(DNT)阳性，小于0.5cm为可疑，无反应或仅红肿为阴性。可疑须复试。阳性株对照坏死区直径应大于1.0cm，阴性株及马了汤对照应均为阴性。阳性结果记为DNT ，阴性结果记为DNT-。
2.3.3.2.3荚膜型简易鉴定方法
2.3.3.2.3.1透明质酸产生试验(改良Carter氏法)
在0.2%脱纤牛血马丁琼脂平板上于中线以直径2mm铂圈均匀横划一条已知产生透明质酸酶的金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)或等效的链球菌新鲜血斜培养物，将每株多杀巴氏杆菌分离物的血斜面过夜培养物，与该线呈直角的线两侧，各均匀划种一条同样宽的直线，并设荚膜A型及D型多杀巴氏杆菌参考株作对照。37℃培养20h，A型株临接葡萄球菌菌苔应产生生长抑制区，此段菌苔明显薄于远端未抑制区，荧光消失，长度可达1cm，远端菌苔生长丰厚，特征荧光型(Fo型)不变，两段差别明显。D型株则不产生生长抑制区，Fo型荧光不变。个别A型分离物不产生明显多量的透明质酸，本法及吖啶黄试验时判定为D型，间接血凝试验(Sawada氏法)则判定为A型。
2.3.3.2.3.2吖啶黄试验(改良Carter氏法)
分离株的0.2%脱纤牛血马丁琼脂18h～24h培养物，括取菌苔，均匀悬浮于pH 7.0 0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水中。取0.5mL细菌悬液加入小试管中，与等容量0.1%中性吖啶黄蒸馏水溶液振摇混合，室温静置。D型菌可在5min后自凝，出现大块絮状物，30min后絮状物下沉，上清透明。其他型菌不出现或仅有细小的颗粒沉淀，上清浑浊。
2.4猪支气管败血波氏杆菌K凝集抗体检查
2.4.1使用须知
2.4.1.1本试验是使用猪支气管败血波氏杆菌I相菌福尔马林死菌抗原，进行试管或平板凝集反应检测感染猪血清中的特异性K凝集抗体。其中平板凝集反应适用于对本病进行大批量筛选试验，试管凝集反应作为定性试验。
2.4.1.2哺乳早期感染的仔猪群，自1月龄左右，逐渐出现可检出的K抗体，到5～8月龄期间，阳性率可达90%以上，以后继续保持阳性。最高K抗体价可达1:320～640或更高，3周龄以上的猪一般可在感染后10d～14d出现K抗体。
2.4.1.3感染母猪通过初乳传递给仔猪的K抗体，一般在出生后1～2个月内消失；注射过猪支气管败血波氏杆菌菌苗的母猪生下的仔猪，则被动抗体延缓消失。
2.4.2试验材料
2.4.2.1抗原。
2.4.2.2标准阳性和阴性对照血清。
2.4.2.3被检血清:应新鲜，无明显蛋白凝固，无溶血现象和无腐败气味。
2.4.2.4稀释液:为pH7.0磷酸盐缓冲盐水。配方如下:磷酸氢二钠(Na2HPO4
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