动物细胞培养

动物细胞培养

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动物细胞培养
第一章绪论和基本理论知识
第一节绪论
一、细胞培养的基本根念
体外培养的三个层次：
①组织培养(Tissue Culture)：指的是从体内取出组织摹拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营
养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。
②细胞培养(Cell Culture)：用的也是同样方法，培养物是单个细胞或细胞群。
在培养组织过程中，现代的培养技术尚不能在体外长期维持组织的结构和机能长期不变。生存环境的
改变，加上细胞的移动(运动)和其它一些影响，培养时间过长，特别是反复传代，很容易导致细胞发生变
动或出现单一化现象，即趋向于变成单一类型细胞，最终便也成了细胞培养。另外所谓细胞培养，也并不
意味细胞彼此是独立的。细胞在培养中的生命活动和在体内时一样，仍然是相互依存的，呈现着一定“组
织”特性。所以，组织培养和细胞培养并无严格区别。因此这两个可作为同义语使用。
③器官培养(Organ Culture)：指的是应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部
分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。
以上三个层次的培养，又可统称之为体外培养(In Vitro)。
┌细胞培养
体外培养┤组织培养
└器官培养
二、对细胞培养的评价
组织培养不仅是一种技术，也是一种科学。从广义上说组织培养分为动物组织培养和植物组织培养两
大类。本课只涉及动物组织培养。组织培养在生物科学和现代医学研究中应用极为广泛，这与其有一系列
优点是分不开的。
优点：
①能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动；可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学
等多种学科的研究工作。
②便于使用摄影、摄电影行和闭路电视等方法进记录，能直接观察活细胞变化。
②可供研究的细胞种类极其广泛，从低等生物到高等动物，以及人类；从胚胎到成体；从正常组织到肿瘤
细胞，皆可用于培养。
④便于使用各种不同的技术方法，如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、组织化学、同位素标记等方
法观察和研究细胞。
⑤培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组(Genome)，也是分子生物学和基因工程学的研究对象；细胞培
养技术已是分子生物学和基因工程的重要组成部分。
⑥易于施用物理、化学和生物因素等进行实验研究。
⑦可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少，比较经济。
⑧已成为生物制品、单克隆抗体生产和基因工程制品等的生产手段。

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不足： 主要是组织和细胞离体以后，独立生存在人工培养环境中，即使当前模拟体内技术发展很快，但
与体内环境相比，仍有很大差异。因此在利用培养细胞做实验对象时，不应视为与体内细胞完全一样，把
实验结果外推至体内，轻易做出与体内等同的结论。
组织培养仍在发展中，很多技术日臻完善，随分子生物学、基因工程的不断发展和对细胞分化认识的
日益深入，我们相信，最终必能创出与体内更加相似的条件，使组织培养的应用价值更大。
三、组织培养发展简史
对组织和细胞的研究经历了四个世纪，其中组织培养的发展也经历近百年时间。
据文献记载:
①最早是德国人Roux(1885)曾用温生理盐水在体外培养鸡胚组织并使之活了数月之久，这被认为是组
织培养的萌芽试验。
②1903 年Jolly 用盖片悬滴培养法，培养蜂蜕白细胞生活了近一个月。
③1906 年Beebe 和Ewing 用同样方法以动物血清做培养基，培养狗淋巴细胞存活了72 小时，并曾见
到细胞生长现象。
人们从上述试验得出一个重要的结论，即组织或细胞离体以后，在人工培养条件下，仍然能够生存。
因此这些早期的培养法，今天看来虽很简陋，却为以后组织培养的建立和发展提供了依据。
(一)观代组织培养的建立
一般认为现代组织培养是从Harrison 和Carrel (1907，1912)两人开始的。
①Harrison 参考前人经验，创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法。此法的基本技术是在无菌条件下，
采用淋巴液做培养基，培养蛙胚神经组织生活了数周，并曾观察到神经细胞突起的生长过程。由此建立了
体外培养组织和细胞的基本模式系统。但要维持细胞在体外长期生存和生长，还必须克服污染和解决营养
问题。
②Carrel 是外科医生，在实验中特别注意无菌操作。他用血浆包埋组织块外加胎汁的培养法，并采用
了更新培养基和分离组织的传代措施，从而完善了经典的悬滴培养法(Suspension Culture)。Carrel 用这种方
法，曾培养一鸡胚心肌组织长达数年之久。
这些创造性的工作充分揭示，离体的动物组织在培养条件下，具有近于无限的生长和繁殖能力；并充
分证明，组织培养的确是研究活组织和细胞的极好方法。
1924 年Maximow 又把Carrel 的悬滴培养法改良为双盖片培养，使之更易于传代和减少污染。
Carrel(1923)又设计了用卡氏瓶培养法，扩大了组织的生存空间。自悬滴培养问世后的30 年中，以Harrison
和Carrel 为首的科学家们，用这些方法对各种组织在体外生长的规律和细胞形态进行了深入的研究，发表
了大量论文，为组织培养的进一步发展奠定了巩固的基础。
(二)组织培养的发展
在悬滴培养法的基础上，从50 年代起，组织培养进入了一个更加迅速发展的阶段。相继有很多学者，
从改进培养操作技术方法、培养容器和培养液三个方面，作了很多革新。在卡氏瓶原理的启示下，出现了
用试管培养。以后人们又设计出多种类型的培养瓶。从40 年代开始，大多数培养工作都过渡到用瓶子培
养。培养基由天然动物血浆改进为应用人工合成培养基(或称限定培养基)；促细胞生长物质从胎汁改用动
物血清。与此同时，培养技术方法的革新进展也非常迅速。Dulbecco(1957)等采用胰蛋白酶消化处理和应
用液体培养基的方法，获得了单层(细胞)培养(Single Layer Culture)。单层培养法的出现，对组织培养的发
展起了很大的推动作用。此后单层培养便成了组织培养普遍应用的技术。用单层培养法得以建立了很多细
胞系(Cell Line)。1948 年Sanford 创建了单细胞分离培养法，应用这一技术可以建立遗传性状相同的克隆细
胞株(Cell line 或Cell Strain)。根据研究工作的特殊需要，1951 年Pomerat 设计了灌流小室，使细胞生活在
不断更新的培养液中，便于做显微摄电影和细胞代谢等研究。

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(三)现代组织培养
从50 年代末起，组织培养技术的应用
进入了一个繁盛的阶段。生物科学和技术科
学相互渗透、遗传学和生物化学相互结合的
结果，出现了分子遗传学、分子生物学、细
胞工程等新兴科学。这些新科学的形成和发
展都与组织培养有密切关系。当前组织培养
技术已广泛用于生物学和医学研究各个领
域。反之通过应用又促进了组织培养技术的
发展。如出现了用各种理化措施诱发出遗传
缺欠细胞株、应用细胞杂交瘤技术制备单克
隆抗体、用培养细胞检测环境中可疑致癌
物、癌基因转染和细胞转化等各种新技术。
当前的组织培养技术不仅是用于研究生命
科学理论的重要技术方法，也日益成为生物
工程和基因工程的生产手段。如新的中空纤
维培养法一次可培养细胞1.2×l011 个，能用
于生产多种生物制品。
近年随着科技工业的发展，供细胞培养
用的各种条件，如瓶皿、培养基和血清等都
已商品化和系列化，使细胞培养工作已成为
轻而易举的事情。采用低温冷冻技术可把已
建立的多种细胞系和细胞株长期冻存起来。
应用冻存技术，在一些发达的国家已建立了
统一冻存细购的细胸库或中心。如美国的
ATCC(American Tissue Culture Collection)；
HGMR(Human Genetic Mutant Repository)，
CAR(Cell Aging Repository)等。在英国和日 本等也有类似的机构。我国在上海和昆明也建立了小规模储存
细胞的实验室。现在全世界健存细胞的数量已难以计算。这些设施为开展组织培养技术和应用培养细胞进
行研究工作提供了极大的方便。
(四)我国组织培养的发展
早在30 年代组织培养技术已传入我国，张钧、鲍鉴清教授曾分别在上海和北平倡导过组织培养方法，
并进行过一些实验工作。但因当时条件所限，终未能建立起稳定的组织培养研究室。
我国组织培养工作基本上是从50 年代开始的。1952 年鲍鉴清首先在天津建立了组织培养实验室并编
写了《组织培养技术》(1954)。在此前后，北京、上海、武汉、长春各地也相继建立了用于医学研究或制
备生物制品的组织培养室。我国组织培养应用于微生物研究是比较早的(唐仲章1953，汤飞凡1956，王潜
渊1957)。50 年代末HeLa 等细胞系被引入我国(闻仲权1957)。应用组织培养的研究工作时有报道(李昌遵
1959，李何民1959)。
60 年代组织培养研究有了更进一步的发展。应用组织培养技术进行各种研究日趋增长。对微生物和病
毒研究发展最快(郭辉玉1960，冯慧敏1963)。在其他领域也得到了应用，如肿瘤细胞培养(潘琼娟1960，
鄂征1962)、神经细胞培养(鲍玻1962，邵文割1962，郭婉华1963)、细胞培养染色体显示（吴曰文1960)、
白细胞培养染色体研究(项维、刘祖洞1962、吴吴、凌丽华1963、汪安奇、周宪庭、周焕庚1964，王志澄
1964)。与此同时细胞培养新技术的引入和改良也不断增多：如羊膜细胞培养技术(曾毅1963，陈乃嘉1964)、

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培养细胞支原体的污染和排除(萧顺1964)、改良灌流小室培养(陈瑞明，沈鼎武1964)，建立细胞系的的工
作也开展起来(何申、陈泉光1963)。
从70 年代起，我国组织培养技术发展更快。它已不再是个别研究室所拥有的技术，已成了医学和生
物学研究中普遍应用的手段。主要是如下的情况导致：
① 近二十年来已建立的人和各种动物肿瘤及其它细胞系，已不可胜数。细胞培养库已初建成。
② 细胞培养用品，培养基、血清、试剂等也已商品化。一次性培养用品也逐渐使用，各种精巧的培养用
具不断进入实验室，极大地促进了培养技术的发展。
③ 在应用组织培养的研究中，电镜观察技术、放射性核素标记、单细胞显微注射、荧光免疫、电泳技术、
细胞融合杂交瘤技术、DNA 转染和细胞转化、分子杂交等各种新技术的使用已较普遍。实验研究已从
细胞深入到分子水平。对很多现代课题如细胞转化、癌变机理、单克隆抗体、基因表达和癌基因等，
进行着广泛的研究，
(五)对组织培养工作者的要求和工作方法
有人认为，做组织培养工作，只要掌握了培养技术，细胞生长了，就算大功告成