第八章 分子印迹技术
将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程称为印迹技术（blotting）。
Southern在1975年首先提出了分子印渍的概念。他将琼脂糖凝胶电泳分离的 DNA片段在凝胶中进行变性使其成为单链，然后将一张硝酸纤维素(nitrocellulose， NC)膜放在凝胶上，上面放上吸水纸巾，利用毛细管作用原理使凝胶中的DNA片段转移到 NC膜上，使之成为固相化分子。载有DNA单链分子的 NC膜就可以在杂交液与另一种带有标记的 DNA或RNA分子(即探针)进行杂交，具有互补序列的RNA或DNA结合到存在于 NC膜的 DNA分子上，经放射自显影或其他检测技术就可以显现出杂交分子的区带。由于这种技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称为“blotting”，译为印迹技术。
生物大分子印迹技术发展极为迅速，己广泛用于 DNA、RNA、蛋白质的检测。通常人们将DNA印迹技术称为Southern blotting，将RNA印迹技术称为Northern blotting，将蛋白质印迹技术称为Western blotting，将不经凝胶的印迹技术称为斑点印迹（Dot blotting）。
实验二十九 Southern印迹
【目的】
1．掌握Sorthern blotting的基本原理
2．熟悉Sorthern blotting的实验操作
【原理】
Southern印迹是将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。
DNA分子经限制性核酸内切酶酶切，经琼脂糖凝胶电泳将得DNA片段按分子量大小分离，然后将含DNA片段的琼脂糖凝胶变性，并将单链DNA片段转移到硝酸纤维素膜或其它固相支持物上，而各DNA片段的相对位置保持不变，这种滤膜可用于杂交反应。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析(RFLP)等。
【操作】
(1)取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切。DNA的量根据样品的种类及目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.1～0.5μg即可；而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因顺序，则需要10～20ug；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时，则需要多至30～50μg。酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳，在其中1孔中加入适当的DNA分子量标准参照物。电泳结束后，溴化乙锭(EB)染色，长波紫外线下观察电泳结果，用1张保鲜膜覆盖在凝胶上，复制下各分子量参照物及各DNA样品带的位置，在凝胶旁置1标尺照像。
(2)切除无用的凝胶部分。将凝胶的左下角切除，以便于定位，然后将凝胶置于一搪瓷盒中。
(3)将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放1小时使之变性，不间断地轻轻摇动，对于较大的DNA片段(如大于15kb)，可在变性前用0.2mol／L HCl预处理10分钟使其脱嘌呤后，再进行碱变性处理。
(4)将凝胶用去离子水漂洗1次，然后浸泡于适量的中和液中30分钟，不间断地轻轻摇动。换新鲜中和液，继续浸泡15分钟。
(5)如图8-1所示，在一塑料或玻璃平台上铺一层Whatman 3mm滤纸，此平台要求比凝胶稍大。将此平台置于一搪瓷盒或玻璃缸中，搪瓷盒中盛满10×SSC。滤纸的两端要完全浸没在溶液中，将滤纸用20×SSC湿润，用一玻璃棒将滤纸推平，并排除滤纸与玻璃板之间的气泡。
(6)裁剪一块与凝胶大小相同或稍大的硝酸纤维素膜。注意操作时要戴手套，千万不可用手触摸，否则油腻的膜将不能湿润，也不能结合DNA。
(7)将硝酸纤维素滤膜漂浮在去离子水中，使其从底部开始向上完全湿润。然后置于20×SSC中至少5分钟。注意滤膜如果不能被湿润则不能用。
(8)将浸泡好的凝胶上下颠倒后，置于上述铺了一层Whatman 3mm滤纸的平台中央。注意两者之间不要有气泡。
(9)在凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严，以防止在转移过程中产生短路(转移液直接从容器中流向吸水纸而不是经过凝胶)，从而使转移率降低。
(10)将湿润的硝酸纤维膜小心覆盖在凝胶上，膜的一端与凝胶的加样孔对齐。排除两者之间的气泡。相应地将膜的左下角剪去。注意膜一经与凝胶接触即不可再移动，因为从接触的一刻起，DNA已开始转移。
(11)将两张预先用2×SSC湿润过的与硝酸纤维素膜在大小相同的Whatman 3mm滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上，排除气泡。
(12)裁剪一些与硝酸纤维素膜大小相同或稍小的吸水纸，约5～8cm厚。将之置于Whatman 3mm滤纸之上。在吸水纸之上置一玻璃板，其上压一重约500g的物品，如图8-1所示。
(13)静置8～24小时使其充分转移，其间换吸水纸1~2次。
(14)弃去吸水纸和滤纸，将凝胶和硝酸纤维素膜置于1张干燥的滤纸上。用软铅笔或圆珠笔标明加样孔的位置。
(15)凝胶用溴化乙锭染色后紫外线下检查转移的效率。硝酸纤维素膜浸泡在6×SSC溶液中5分钟，以去除琼脂糖碎块。
(16)硝酸纤维素膜用滤纸吸干。然后置于两层干燥的滤纸中，真空下80℃烘烤2小时，此过程使DNA固定于硝酸纤维素膜上。
(17)此硝酸纤维膜即可用于下一步的杂交反应。如果不马上使用，可用铝箔包好，室温下置干燥处保存备用。
(18)如用于杂交，杂交方法见实验三十二。
【器材】
琼脂糖电泳装置：真空泵；真空烤箱；其它实验室常规仪器及试剂。
【试剂】
适当的限制性核酸内切酶
琼脂糖
变性液：1.5mol/LNaCl；0.5mol／L NaOH。
中和液：lmol／L Tris-Cl（pH8.0）；1.5mol／L NaCl。
转移液（20×SSC）：3mol／L NaCl；0.3mol／L柠檬酸钠，pH7.0。
硝酸纤维素膜或尼龙膜
实验三十 Northern印迹
【目的】
1．掌握Northern blotting的基本原理
2．熟悉Northern blotting的实验操作
【原理】
RNA经甲醛或乙二醛-二甲基亚砜变性后，在琼脂糖凝胶中进行电泳，能很好地分离和解旋成单链，其电泳迁移率与分子量的对数呈严格的反比关系，然后将RNA从凝胶上转移到硝酸纤维素膜上，此膜具有吸附单链RNA的特点，加热将RNA固定于硝酸纤维素上，并与所需的放射性探针杂交，杂交后充分洗膜，除去未杂交上的放射性探针，然后进行放射自显影，只有与探针具有互补顺序的RNA片段才能显示出来，从而可以确定特异的RNA片段。
常见的RNA变性凝胶电泳有两种：①乙二醛和二甲基亚砜使RNA变性后，进行凝胶电泳；②通过甲醛变性的凝胶电泳。故有两种Northern转移方法。本节介绍乙二醛-二甲亚基砜系统的转移。用乙二醛变性的RNA电泳后，可直接由凝胶转移到硝酸纤维素膜上，不必进一步处理凝胶。
【操作】
(1)于一托盘中倒入500m120×SSC，在20×SSC溶液中浸泡1张适当大小的Whatman3mm滤纸。
(2)于托盘内横入1块有机玻璃板或1块玻璃板，将浸湿的滤纸乎放在玻璃板上，滤纸两端浸入缓冲液中，作为吸水带，排除滤纸下所有的空气泡。
(3)小心将凝胶翻转放在滤纸上(即加样孔开口朝下)，方法是先将凝胶平放在一块板子上，再在凝胶上盖上一块板子，然后小心地将夹在两块板子的凝胶翻过来，抽下下层板子，使凝胶沿下层板子滑到滤纸上。
(4)用水将硝酸纤维膜湿润，并在20×SSC中浸泡5分钟，平放在凝胶上。
(5)用20×SSC浸湿两张与凝胶同样大的Whatman 3mm滤纸，逐一平放在硝酸纤维膜上。
(6)于Whatman 3mm滤纸上平放一叠与Whatman 8mm滤纸大小相同或略小的纸中(8cm厚)，纸中上置一玻璃板，并与500g重的物体压住，参看Southern转移图。
(7)在室温下转移12～24小时(注意不要使纸中全部浸湿，造成液体倒流)。
(8)移去纸中和凝胶上方的3mm滤纸，取下凝胶和硝酸纤维素膜，翻转后置于干的3mm滤纸上。用软铅笔或圆珠笔在硝酸纤维素膜上标记凝胶样品槽位置。
(9)取下凝胶弃之，硝酸纤维素膜置Whatman 3mm滤纸上，室温晾干。
(10)置80℃真空烤箱烘烤2小时。
(11)杂交方法可参考实验三十二。
【注意事项】
如果凝胶预先用20×SSC浸泡或RNA的溴化乙淀染色，将降低RNA转移的效率。
【器材】
Whatmen 3mm滤纸；硝酸纤维膜；真空烘箱。
【试剂】
20×SSC：称取175.3 g NaCl和88.2 g柠檬酸钠，溶于800ml水中，滴加10 N NaOH溶液到pH 7.0，定容至1000 ml，分装，高压灭菌。
实验三十一 Western印迹检测人血清IgG
【目的】
1．掌握Western blotting的基本原理
2．熟悉Westernblotting的实验操作
【原理】
Western blotting是利用抗体作探针来检测已转移到固相支持物上的靶蛋白。一般先用待测蛋白免疫动物A，获得多克隆或单克隆抗体作为第一抗体与靶蛋白反应，再用另一种动物的抗动物A的免疫球蛋白抗体(放射性标记或酶标记)作为第二抗体。通过放射自显影或特异性酶促反应对固相支持物上的靶蛋白进行检测。这样避免了对每种待测蛋白都要制备放射性标记或酶标记抗体的麻烦。
本实验利用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG抗体直接检测人血清IgG，无需再用第二抗体。先将人血清上样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过转移系统将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维膜上，再用丽春红S(Ponceau S)对硝酸纤维膜染色并用铅笔标出分子量标准的条带(该染料只会短暂显色，进行Western印迹时可被洗去，且与所有免疫学检则方法兼容)，漂洗后再用封闭液(本实验采用牛血清白蛋白)封闭膜上可能结合非相关蛋白的位点以降低非特异性结合的背景，封闭之后滤膜加入酶联抗体温育，漂洗后加入生色底物进行特异性显带。免疫偶联的辣根过氧化物酶最敏感的底物是3，3＇-二氨基联苯胺，它在过氧化物酶所在部位转变成棕色沉淀。在Co2＋或Ni2＋存在下可以加深沉淀的颜色并提高反应的灵敏度。
IgG是由两条轻链和两条重链通过二硫键连接起来，变性后轻链和重链分开，且在轻链和重链的恒定区都具有抗原决定簇，因此在膜上可以显出两条带，一条为轻链(约21KD)另一条为重链(约为57KD)。
【操作】
1．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：见实验二十七，样品为20倍稀释的血清或用实验二十三：A蛋白吸附法纯化血清中IgG的洗脱液，经处理后与蛋白质标准一起上样。
2．电泳即将结束时，切6张Whatman 3MM的滤纸和1张硝酸纤维素滤膜，其大小都应与凝胶大小完全吻合，放入转移缓冲液中浸泡5min以上。
3．在一边的海绵垫上放置3张用转移缓冲液浸泡过的3MM滤纸，逐张叠放，精确对齐，然后用一玻璃移液管作滚筒以挤出所有气泡。把硝酸纤维滤膜放在3MM滤纸堆上，要保证精确对齐，而且在3MM滤纸与滤膜之间不留有气泡。从电泳槽上撤出放置SDS-聚丙烯酰胺凝胶的玻璃，把凝胶转移到一盘去离子水中略为漂洗一下，然后准确平放于硝酸纤维素滤膜上，排除所有气泡。把最后3张3MM滤纸放在凝胶上方，同样须确保各层精确对齐并不留气泡。
4．夹紧夹子，按图8-2装置好，确保凝胶在负极，滤膜在正极，倒满转移缓冲液稳流100mA转移2~3h。
5．关闭电源拆下转移装置，把凝胶转移到盛有考马斯亮蓝染液的托盘中进行染色，以便检查蛋白质转移是否完全。将硝酸纤维膜转移到含有丽春红S使用液的托盘中染色5～10min，其间轻轻摇动染液，蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，其间换水数次。
6．把硝酸纤维素滤膜放入可加热封接的塑料袋中，根据滤膜面积以0.1 m1／cm2的量加入封闭液，尽可能排除里面的气泡，然后密封袋口，平放在平缓摇动的摇床上于室温温育1～2 h。
7．将封闭过的硝酸纤维素滤膜放入另一个塑料袋中，用抗体稀释液800倍稀释抗体，按滤膜面积0.1 ml／cm2加入稀释抗体，密封袋口，平放在摇床上室温温育1 h。
8．将滤膜转移至盛有漂洗液的浅托盘上，于室温平缓摇动，漂洗10min，重复3次。
9．把经漂洗的硝酸纤维素滤膜移至一浅托盘上，按滤膜面积加入0.1 m1／cm2的底物溶液，细心观察反应过程，一旦蛋白带的颜色达到要求(约2min)，即取出滤膜，用去离子水略为漂洗，转移到盛有漂洗液的托盘中。记录条带位置，拍摄滤膜照片，留作永久实验记录。
【注意事项】
1．电泳时不上样的上样孔要加等体积的样品缓冲液，防止样品扩散。
2．从裁剪滤纸到安装整个转移装置，都要戴手套操作，防止污染。
3．滤纸、滤膜应与凝胶大小完全吻合，并要精确对齐，防止短路。
4．加入底物显色时，应仔细观察，蛋白主条带出现后应立即取出，终止反应，否则非特异性结合背景太高，影响实验效果。
【器材】
电泳仪；垂直板电泳槽；转移装置；φ15cm培养皿 ；SearsSeal-A-Medal塑料袋；封口机；摇床；镊子；一次性手套等。
【试剂】
1．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂见实验二十七。
2．稀释血清：取新鲜人血清50ul，加生理盐水0.95ml，加2×样品缓冲液，100℃煮沸3min，冷却。
3．转移缓冲液：2.9 g Gly 5.8 g Tris 0.379 g SDS 200 ml甲醇用水稀释至1L。
4．丽春红S染液
(1)贮存液：2.0 g丽春红S 30 g三氯醋酸 30 g磺基水杨酸，加水至100 ml。
(2)使用液：使用前取1份贮存液加9份去离子水，混匀使用后即废弃。
5．Western blotting缓冲液A液：9 g NaCl 12.1 g Tris，加水500ml溶解，加0.1 mol／L
HCl(标定过)403 ml，调节pH至7.5，定容至1000ml。
6．封闭液： l g牛血清白蛋白 50μl Tween-20，用A液定容至100 ml。
7．稀释抗体：取20μl HRP-羊抗人IgG抗体，加封闭液16 ml，混匀。
8．漂洗液：400 ml A液 1ml Tween-20，混匀。
9．底物溶液
(1)30 mg二氨基联苯胺溶于30ml水，加A液5 ml，过滤定容至50 ml，临用前配，放棕色瓶中。
(2)0.3％CoCl2：称取CoCl2 30 mg溶于10 ml水。
临用时取(1)液9ml (2)液1 ml，加10 ul 30％ H2O2，混匀。
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