有关PCR技术－比较详细

有关PCR技术－－比较详细

第一章 聚合酶链式反应 2
第一节 PCR技术的原理 2
第二节 PCR反应体系 4
一、 模板(template) 4
二、 引物 (primers) 5
三、 反应缓冲系统(reaction buffer system) 8
四、 二价阳离子(divalent)——Mg2 8
五、 三磷酸脱氧核苷酸(deoxynucleotide triphosphates,dNTPs) 9
六、 耐热DNA聚合酶(thermostable DNA polymerase) 9
七、 PCR促进剂 13
第三节 PCR的反应温度和循环参数 13
一、 变性温度与时间 14
二、 退火的温度与时间 14
三、 延伸温度与时间 14
四、 循环次数 15
第四节 PCR反应条件的优化 15
一、 PCR反应条件的选择 15
二、 PCR反应的忠实性 26
三、 平台效应 28
第五节 PCR产物的检测 28
一、 凝胶电泳检测 29
二、 核酸探针杂交检测 29
三、 酶谱分析法 31
四、 DNA酶免疫试验法(PCR-EIA) 31
五、 PCR-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA) 31
六、 颜色互补分析法 31
七、 序列分析法 32
八、 PCR-HPLC法 32
九、 单一核苷酸引物延伸法(SNUPE) 32
十、 PCR-寡核苷酸连接检测法(PCR-OLA) 32
十一、 单链构型多态性分析法(PCR-SSCP) 33
第六节 PCR产物的纯化 33
第二章 DNA模板的制备及PCR技术 35
第一节 DNA模板的制备 35
一、 有机提取法 35
二、 Chelex-100提取DNA 40
三、 无机法提取DNA 41
四、 差异裂解提取法 41
五、 其他方法提取DNA 41
第二节 PCR常见问题及处理 43
一、 PCR扩增参数对扩增目的基因的影响 44
二、 PCR常见问题及处理 44
第三节 PCR技术中污染问题 46
一、 污染原因 46
二、污染的监测 47
三、 防止污染的方法 47
第四节 PCR技术实验室的质量控制 49
一、 设备条件 49
二、 人员条件 49
三、 操作标准问题 49
第三章 原位PCR相关技术 51
第一节 原位PCR 51
一、原位PCR的基本原理 52
二、 原位PCR的方法和原则 52
三、 原位PCR中的问题和技术难点 59
四、 应用前景 60
第二节 原位PCR的分类 60
一、 直接原位PCR 60
二、 间接原位PCR 61
三、 原位反转录PCR 62
第三节 原位PCR技术 63
一、 直接原位单拷贝PCR 63
二、 在细胞和石蜡切片上检测低拷贝DNA序列的原位PCR方法 67
三、 冰冻切片上的逆转录原位PCR 76
四、 HIV-1前病毒 DNA的原位PCR检测及流式细胞仪分析 81
五、 细胞内mRNA的原位PCR扩增 86
六、 组织切片上核酸序列的PCR扩增 93
第四章 定量PCR 技术 100
第一节 概述 100
第二节 基本概念 101
第三节 定量PCR 技术基本原理 101
第四节 定量PCR技术的种类 102
一、 外对照PCR定量 104
二、 有限稀释PCR定量分析 104
三、 内对照PCR 定量 105
四、 非竞争性对照基因定量法 106
五、 竞争性定量PCR 106
六、 PATTY定量分析mRNA法 107
七、 PCR－ELISA法： 107
八、 荧光定量PCR 107
九、 实时定量PCR技术 108
十、 定量PCR的主要影响因素 108
第五节 荧光定量PCR 技术及其在临床上的应用 109
一、 荧光定量PCR 109
二、 实时荧光定量PCR 121
第六节 PCR 产物的定量检测与技术 129
一、 凝胶检测系统 129
二、 HPLC检测系统 129
三、 固相测定系统 129
四、 SPA系统 130
五、 杂交检测系统 130
六、 电化学发光检测系统 130
七、 DNA酶免疫测定系统 131
八、 激光诱导荧光检测法 131
第七节 目前存在的问题及展望 131
第五章 其它相关PCR技术 134
第一节 逆转录—聚合酶链反应 134
一、 原理 134
二、 实验方法 134
三、 常见问题处理 137
第二节 套式PCR 139
一、 原理 139
二、 基本技术 140
三、 套式PCR的应用与评价 141
第三节 多重PCR(MULITIPLEX PCR) 142
一、 原理 142
二、 基本技术 142
三、 多重PCR的应用与评价： 143
第四节 PCR结合等位基因特异性的寡核苷酸探针法(PCR-SSO) 144
第五节 PCR结合序列特异性引物技术(PCR-SSP) 146
第六节 单链构型多态性分析(PCR-SSCP) 147
一、 原理 147
二、 基本技术 147
第七节 限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP) 149
第八节 MVR-PCR 150
一、 原理 150
二、 基本技术 151
三、 应用和评价 152
第九节 RAPD技术 153
一、 原理 153
二、 基本技术 153
三、 技术应用和评价 155
第六章 PCR技术用于构建CDNA文库、测序及基因突变的检测 159
第一节 CDNA文库构建的基本技术 159
一、 经典cDNA文库的构建方法 159
二、 用PCR 方法构建cDNA文库 167
第二节 PCR测序 168
一、 PCR产物直接测序法 168
二、 PCR循环测序法 169
第三节 PCR技术用于基因突变的检测 171
第七章 PCR技术分析DNA序列多态性 176
第一节 DNA的二种多态性和遗传标记分类 176
一、 片段长度多态性(fragment length polymorphism，FLP) 176
二、 序列多态性(Sequence polymorphism) 177
第二节 PCR技术分析DNA序列多态性 177
一、 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism )技术 177
二、 PCR-SSO(sequence specific oligonucleotide-PCR，SSO-PCR)技术 178
三、 PCR测序 178
四、 PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism，SSCP)技术 179
五、 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism ，SNP)及PCR分析 179
六、 线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)多态性及PCR分析 181
第八章 用PCR技术分析VNTR和和STR 188
第一节 概述 188
第二节 扩增片段长度多态性分析分型技术基本原理 189
第三节 用PCR技术分析小卫星VNTR基因座分型的基本技术 190
一、 VNTR基因座特征 190
二、 试剂和器材 190
三、 基本操作步骤 195
四、 常用遗传学数据的统计处理 202
五、 小卫星VNTR扩增分析的质量控制 205
六、 小卫星VNTR扩增分析的应用 206
第四节 用PCR技术分析微卫星(STR)基因座 206
一、 STR基因座特征 206
二、 常用的STR扩增基本技术 207
三、 STR复合扩增(multiplex PCR) 212
四、 STR扩增分析的质量控制 214
五、 STR扩增分析注意的问题 214
六、 PCR分析STR技术的应用领域 217
第九章 用PCR技术对性别染色体进行分析 223
第一节 概述 223
第二节 PCR扩增的基本方法 223
一、 PCR扩增模板的制备 223
二、 主要试剂及其配置、所使用仪器、DNA浓度和纯度的检测方法 224
三、 PCR反应 224
第三节 讨论 226
第十章 用PCR技术对动植物、微生物DNA 进行分析 228
第一节 概述 228
一、 特异性PCR 228
二、 任何引物PCR 231
第二节 实验方法与步骤 233
一、 样品来源 233
二、 主要试剂及其配制 233
三、 基因组DNA的提取及其检测 235
四、 PCR反应： 236
第三节 结果与讨论 238
第十一章 PCR技术检测CDK4敲入转基因鼠的基因型 240
第一节 实验原理 240
第二节 实验方法 240
一、 仪器及试剂配制 240
二、 实验方法 241
第三节 结果 243
第四节 结果分析及注意事项 248