2.λ溶源菌株的获得可通过较为简单的办法得到:用较高浓度的λ裂解液和用于转导的供体菌混合涂布于完全固体平板,同时做λ噬菌体和供体菌的对照。37℃培养过夜后,第二天就能看到混合涂布的平板出现单菌落,而对照涂布λ噬菌体平板无菌落、涂布供体菌平板呈现一片菌落。单菌落的出现是由于大量λ噬菌体把被感染的菌大都裂解掉,而只有少部分对λ噬菌体抗性菌落和λ溶源菌才能生长。只要区分这二种菌落,就能获得所需要的λ溶源菌株。一个简单的办法是把各个单菌落接种于一定体积的完全培养液中,37℃培养一定时间,然后离心除去上清液,用完全培养液制成菌悬液(菌液可浓一些,也可加入一定量的0.1mol/LCaCl2),各挑取一环菌液滴加于涂有菌液(对λ噬菌体敏感的指示菌)的完全固体平板上,然后以一定距离的U、V照射,37℃培养过夜,第二天观察是否有噬菌斑出现,如果噬菌斑出现,表明相应的单菌落是λ溶源菌,反之是λ噬菌体抗性菌。
同样,对低频转导的转导子进行上述的实验就能分离到高频转导的双重溶源菌,因为双重溶源的转导子经U、V照射也将会释放λ噬菌体感染敏感细菌而产生噬菌斑,相反,其它转导子经U、V照射不释放λ噬菌体不形成噬菌斑,这样我们将容易区分这种状态的转导子,而获得我们所需要的双重溶源性菌株。
五、实验步骤
1.噬菌体裂解液的制备
(1)前一夜挑取一环供体菌(K12(λ)gal )接种于含有5毫升肉汤培养液的试管中,37℃培养过夜,然后吸取0.5毫升菌液于含有4.5毫升肉汤培养液的三角瓶中,继续培养3—4小时。
(2)将三角瓶的菌液倒入离心管,3500转/分离心10分钟。
(3)除去上清液,加4毫升磷酸缓冲液,制备菌悬液。
(4)取菌悬液3毫升于灭菌培养皿中,经U、V(15W、距离40厘米)处理,诱导10分钟。
(5)处理后加入3毫升2E肉汤培养液,37℃避光培养3-5小时。
(6)吸取培养液于灭菌离心管中,3500转/分离心10分钟,然后小心吸取上清液于另一支塞有软木塞的灭菌离心管中,加入0.2毫升氯仿(4—5滴),剧烈振荡半分钟,静止5分钟,小心把上清液用无菌吸管移入另一支灭菌试管(即λ噬菌体裂解液),供效价测定和转导用。
2.λ噬菌体的效价测定(λ噬菌体总数/毫升)
(1)前一夜挑取一环受体菌(K12gal-)接种于含有5毫升肉汤培养液的试管中,37℃培养过夜。
(2)吸取0.5毫升培养液于含有0.25毫升0.1mol/LCaCl2的4.5毫升肉汤培养液的三角瓶中,继续培养3—4小时。
(3)取已经熔化并于45℃保温的半固体琼脂试管(每管3毫升)4支,每支试管加入上述经活化后菌液0.5毫升。
(4)吸取λ噬菌体裂解液0.5毫升于含有4.5毫升肉汤培养液的试管中,依次稀释到10-6与10-7。
(5)从10-6和10-7试管中分别吸取0.5毫升于上述已加有菌的半固体试管中(每个稀释度2支),搓匀、分别倒入预先倒好并已凝固的肉汤固体培养基上,摇匀、待凝、37℃培养过夜。
(6)观察出现噬菌斑数,并估计λ噬菌体裂解液的效价(λ噬菌体数/每毫升)。
3.转导
A.点滴法:
(1)取预先倒好的EMB培养基二皿,在皿底用玻璃铅笔按下图的样子画好。
(2)取受体菌(经活化后菌液)一环,按上述图示涂二条菌带,37℃培养1.5小时。
(3)从温箱中取出培养皿,在二个圆圈和四个方格处,各滴加一环λ噬菌体裂解液(先滴加圆圈处再滴加方格处),圆圈处为λ噬菌体对照,方格处为转导试验,菌带为受体菌对照,37℃培养二天,观察结果。
B.涂布法:
(1)取预先倒好的EMB培养基四皿,其中一皿加0.1毫升λ噬菌体裂解液,用于对照;一皿加0.1毫升经活化后受体菌,也用于对照;另二皿加λ噬菌体裂解液和受体菌各0.05毫升。
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