核酸及其衍生物,核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收 UV 的性质,其吸收高峰在 260nm 波长处。 核酸的摩尔消光系数(或称吸收系数)用 来表示。 为每升溶液中含有 1 克原子核酸磷的光吸收值(即 A 值)(表)。测得未知浓度核酸溶液的 A 260nm 值,即可以计算出其中 RNA
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紫外吸收法测定核酸的含量

点击:   作者:   来源:  时间: 2007-10-15  本站论坛
核酸及其衍生物,核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质,其吸收高峰在260nm波长处。

核酸的摩尔消光系数(或称吸收系数)用 来表示。 为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值(即A值)(表)。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值,即可以计算出其中RNADNA的含量。该法操作简便,迅速,并对被测样品无损,用量也少。

 

核酸摩尔消光系数及相光数值

 

ε(P) 

含磷量/(%)

A260nm 

 

pH7260nm

1µg/ml

RNA

7700-7800

9.5

0.022-0.024

DNA-Na

6600

9.2

0.02

(小牛胸腺)

 

 

 

   

蛋白质和核苷酸也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处,在260nm出的吸收值仅为核酸的1/10或更低,因此对于含有微量蛋白质的核酸样品,测定误差较小。RNA260nm280nm吸收的比值在2.0以上;DNA260nm280nmx吸收的比值则在1.9左右,当样品中蛋白质含量较高时,比值下降。若样品内混在有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质,应设法先除去。

 

 

 

 

 

试剂和器材

 

一、试剂

钼酸铵-过氯酸沉淀剂:取3.6ml70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4ml蒸馏水中,即成0.25%钼酸铵-2.5%过氯酸溶液。

5-6%氨水:用25-30%氨水稀释5倍。

 

 

二、测试样品

干酵母粉(RNA)。

 

三、器材

电子分析天平,离心机,离心管,紫外分光光度计,烧杯,冰浴,容量瓶(50ml),移液管,试管及试管架。

 

 

操作方法

 

、准确称取待测的核酸样品0.5g,加少量0.01mol/LNaOH调成糊状,再加适量水,用5-6%氨水调至pH7.0,定容至50ml

取两支离心管,甲管加入2ml样品溶液和2ml蒸馏水,乙管加入2ml样品溶液和2ml沉淀剂。混匀,在冰浴上放置30min,在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5ml上清液,用蒸馏水定容至50ml。选择厚度为1cm的石英比色杯,在260nm波长处测定A值。

 

 

二、计算:

式中, 为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释液在260nm波长处A值。

核酸%

在本实验中,1ml待测液中制品量为50μg


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