| 核酸及其衍生物,核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质,其吸收高峰在260nm波长处。
核酸的摩尔消光系数(或称吸收系数)用 来表示。 为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值(即A值)(表)。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值,即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便,迅速,并对被测样品无损,用量也少。
表 核酸摩尔消光系数及相光数值
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ε(P)
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含磷量/(%)
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A260nm
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pH7,260nm
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1µg/ml
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RNA
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7700-7800
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9.5
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0.022-0.024
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DNA-Na盐
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6600
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9.2
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0.02
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(小牛胸腺)
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蛋白质和核苷酸也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处,在260nm出的吸收值仅为核酸的1/10或更低,因此对于含有微量蛋白质的核酸样品,测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上;DNA的260nm与280nmx吸收的比值则在1.9左右,当样品中蛋白质含量较高时,比值下降。若样品内混在有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质,应设法先除去。
试剂和器材
一、试剂
钼酸铵-过氯酸沉淀剂:取3.6ml70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4ml蒸馏水中,即成0.25%钼酸铵-2.5%过氯酸溶液。
5-6%氨水:用25-30%氨水稀释5倍。
二、测试样品
干酵母粉(RNA)。
三、器材
电子分析天平,离心机,离心管,紫外分光光度计,烧杯,冰浴,容量瓶(50ml),移液管,试管及试管架。
操作方法
一 、准确称取待测的核酸样品0.5g,加少量0.01mol/LNaOH调成糊状,再加适量水,用5-6%氨水调至pH7.0,定容至50ml。
取两支离心管,甲管加入2ml样品溶液和2ml蒸馏水,乙管加入2ml样品溶液和2ml沉淀剂。混匀,在冰浴上放置30min,在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5ml上清液,用蒸馏水定容至50ml。选择厚度为1cm的石英比色杯,在260nm波长处测定A值。
二、计算:
式中, 为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释液在260nm波长处A值。
核酸% =
在本实验中,1ml待测液中制品量为50μg。
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