| 由于RNA的来源和种类很多,因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后,RNA即溶于上层被酚饱和的水相中,DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后,RNA即以白色絮状沉淀析出,此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA,用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA,主要用作制备核苷酸的原料,其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液,90℃提取3-4h,迅速冷却,提取液经离心后,上清液用乙醇沉淀RNA。
稀碱法使用稀碱(本实验用0.2%NaOH溶液)使酵母细胞裂解,然后用酸中和,除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。
酵母含RNA达2.67-10.0%,而DNA含量仅为0.03-0.516%,为此,提取RNA多以酵母为原料。
RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解,从水解液中可用定糖,定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。
试剂和器材
一、试剂
0.04MNaOH溶液;95%乙醇;无水乙醇;乙醚;1.5M硫酸;浓氨水;0.1M硝酸银;
酸性乙醇溶液,30ml乙醇加0.3ml HCl;
三氯化铁浓盐溶液,将2ml 10%三氯化铁(FeCl3· 6H2O)溶液加入400ml浓HCl;
苔黑酚乙醇溶液,称取6g 苔黑酚溶于95%乙醇100ml;
定磷试剂:
17%硫酸:将17ml浓硫酸(比重1084)缓缓倾入83ml水中;
2.5%鉬酸铵:2.5g 鉬酸铵溶于100ml水中;
10%抗坏血酸溶液:10g 抗坏血酸溶于100ml 水,棕色并保存溶液;
临用时将三种溶液和水按下列比例混合:
17%硫酸:2.5%鉬酸铵:10%抗坏血酸:水=1:1:1:2(V/V)
二、材料
干酵母粉。
三、器材
乳钵;容量瓶(10ml),移液管(2.0ml, 5.0ml),量筒(10, 50ml),沸水浴,离心机,布氏漏斗,抽滤瓶,石蕊试纸,滴管等。
操作方法
一、酵母RNA提取
称5g干酵母粉置于100ml烧杯中,加入40ml0.2%NaOH溶液,沸水浴上加热30min,经常搅拌。然后加入数滴乙酸溶液使提取液呈酸性(石蕊试纸检查),3000r/min离心15min。取上清液,加入10ml酸性乙醇,边加边搅动。加毕,静置,待RNA沉淀完全后,离心。滤渣先用乙醇洗两次,每次用10ml。再用无水乙醇洗两次,每次10ml,洗涤时间可用细玻璃棒小心搅动沉淀。最后用布氏漏斗抽滤,沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量,计算:
二、RNA组份鉴定
取2g 提取的核酸,加入1.5M硫酸10ml, 沸水浴加热10分钟制成水解液,然后进行组份鉴定。
1.嘌呤碱:取水解液1ml 加入过量浓氨水。然后加入1ml 0.1M硝酸银溶液,观察有无嘌呤碱地银化合物沉淀。
2.核糖:取水解液1ml, 三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。
3.磷酸:取水解液1ml,加定磷试剂1ml。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。
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