引物和探针设计软件Primer Express操作步骤

1. 软件登录
双击Primer Express软件的图标，登录软件，显示主页面。
如果是首次登录，会出现一个对话框要求创建或打开一个Archive文件。点击New创建一个新archive文件，点击Save将此文件保存为PXArchive。
从File菜单中选择New，再选择DNA PCR或其他类型的引物设计页面，如Nested PCR、Multiplex PCR等，打开一个新DNA PCR文件。

2. 输入DNA序列
在Sequence页面，点击Import DNA File按钮，出现搜索路径对话框。
找到所需序列文件，点击Open。

3. 计算引物
从Optains菜单中选择Find Primers Now，几秒钟后，显示其中一对引物在Sequence中的位置。点击Primers标签打开引物页面，可以看到总共有多少对引物被设计出来，以及所有引物的序列。
这时显示的引物多少取决于模板的序列和引物参数的严格程度，可能只有几对，可能有很多，也有可能一对引物也没有。在所得引物中选择罚分(Penalty)最低的引物即为引物设计结果。
如果计算后没有任何引物，或者你对缺省的引物参数不满意，则需要对引物参数进行适当调整以符合特定实验的要求，得到最佳引物。引物太多，可以严格参数，使引物数量减少，质量提高；引物没有，可以放宽非关键性的参数，以便在不影响引物质量的前提下计算出引物。

4. 修改参数，计算最佳引物
点击Params标签打开参数页面。根据需要调整引物参数，如Tm值，GC百分含量，引物和扩增子的长度等。然后点击Primers标签打开引物页面，再从Optains菜单中选择Find Primers Now，重新计算引物，几秒钟后，显示新的计算结果。
此步骤可以反复多次，直到得到满意的引物为止。
根据罚分(Penalty)由低到高的秩序排列所得引物，取罚分最低的第一对引物。罚分是该引物与参数符合程度的衡量指标。分数越低，表示该引物与要求符合得越好。

5. 引物参数定义

Primer T m Requirements
Min Tm Minimum melting temperature allowed for either primer.
Max Tm Maximum melting temperature allowed for either primer.
Optimal Tm Optimal melting temperature desired. This figure is used when
calculating optimal primer pairs.
Maximum Tm Difference
Maximum difference allowed between the T m s of each primer
in the primer pair.

Primer GC Content Requirements
Min %GC Minimum percentage of G and C contained by either primer.
Max %GC Maximum percentage of G and C contained by either primer.
GC Clamp Number of residues on the 3′ end required to be a G or C.

Primer Length Requirements
Min Length Minimum length allowed for either primer.
Max Length Maximum length allowed for either primer.
Optimal Length Optimal primer length desired. This figure is used when
Calculating optimal primer pairs.

5' Tail
Forward Primer You can specify a sequence to search for as the forward primer.
Reverse Primer You can specify a sequence to search for as the reverse primer.

6. 保存
从File菜单中选择Save或Save as，出现保存对话框，命名以后保存文件。从File菜单中选择Quit退出Primer Express软件。