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高效液相色谱法测定疣克酊中鬼臼毒素的含量
张琰，程建峰，贺建荣（第四军医大学唐都医院药剂科，陕西 西安 710038）
中图分类号：R927.2 文献标识码：A 文章编号
摘要：目的：建立疣克酊中鬼臼毒素含量的高效液相色谱测定方法。方法：以Discovery C18（4.6×250mm，5μm）为分析柱，以甲醇-水（50∶50，V/V）为流动相，检测波长285nm，流速为0.8 mL·min -1。结果：当鬼臼毒素的浓度在24.8~99.2μg·mL-1范围内时，面积与浓度间呈良好的线性关系（r= 0.9999，n=6），方法的平均回收率为98.51%，日内和日间精密度分别为3.8%和4.1%。三批疣克酊剂中鬼臼毒素的百分含量分别为102.00%，101.46% 和100.39%。结论：本方法具有准确简便，灵敏且重现性好的特点，可适用于复方制剂中鬼臼毒素含量的测定。
要害词：鬼臼毒素；含量测定；高效液相色谱法
Determination of Podophyllotoxin in YOUKEJING tincture by HPLC
ZHANG Yan，CHENG Jianfeng，HE Jianrong
(Department of Pharmacy, Tangdu Hospital, Fourth military medical university, Xi’an Shanxi 710038)
Abstract Objective: To establish HPLC method for the determination of podophyllotoxin in YOUKEDING tincture. Methods: The Discovery C18（4.6×150mm，5μm）was used as analysis column. The mobile phase was methanol-water（50∶50，V/V）. Detection wavelength was 285 nm. The flow rate was 0.8 mL·min-1 . Results: The calibration curves was linear in the concentration range of 24.8~99.2μg·mL-1（r=0.9999,n=6）. The average recovery was 98.51%（RSD=0.48%）.The contents of podophyllotoxin in YOUKEDING tincture were 102.00%，101.46%，100.39% respectively. Conclusion: The method is simple，accurate， sensitive and good reproducible. It is suitable for the determination of podophyllotoxin and its preparations.
Key word podophyllotoxin, content determination, HPLC
疣克酊剂是以鬼臼植物中提取的鬼臼毒素为主配制的复方酊剂，其主要成分为鬼臼毒素和阿司匹林等，通过近年来的临床应用，该制剂在治疗尖锐湿疣及扁平疣等方面取得了良好的效果，临床疗效观察表明，复方制剂中鬼臼毒素的浓度过高，易引起皮肤的浅表糜烂、局部水肿及剧烈疼痛，而浓度过低则疗效较差，准确的控制好复方制剂中鬼臼毒素的浓度有着重要的意义。目前，药材中鬼臼毒素含量测定已有变色酸法[1]、羟胺-三氯化铁法[2]、薄层扫描等方法被报道[3-5]，但疣克酊为复方制剂，内源性物质的干扰较强，上述方法不能用于复方制剂中鬼臼毒素的定量分析，对此，本文建立以RP-HPLC测定疣克酊剂中鬼臼毒素含量的方法，试用结果表明，本方法具有准确度高，专属性强的特点，可用于鬼臼毒素及其制剂分析。
1.仪器与试药
1.1 仪器：日本Shimadzu LC-10AVP高效液相色谱系统，含两台LC-10Atvp型泵，7725型进样阀（配100μL定量环），SPD-M10Avp二极管阵列紫外可见检测器，CTO-10Asvp柱箱，Class-vp5.0色谱工作站。Discovery C18不锈钢分析色谱柱（4.6×250mm，5μm）。
1.2 试药：鬼臼毒素对照品（Sigma公司，含量98.8%）,疣克酊剂（自制，批号：010508，010509，010510）。甲醇为色谱级，其它化学试剂均为分析纯。
2.方法与结果
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2.1 色谱条件 分析色谱柱为Discovery C18（4.6×250mm，5μm），流动相的组成为：甲醇-水（50∶50，V/V），检测波长:285nm，流速0.7mL·min -1，柱温：20℃，进样量50μL，鬼臼毒素的色谱分离结果见图1。
图1 疣克酊酊剂的HPLC色谱图（鬼臼毒素的tR =21.160min）
2.2 线性关系考察 精密称取鬼臼毒素对照品49.6mg，置100mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取0.5，0.75，1，1.5，2mL置10mL量瓶中，以流动相稀释成浓度为24.8、37.2、49.6、74.4和99.2 μg·ml-1的标准溶液，进样50μL供HPLC分析，记录色谱峰面积。以鬼臼毒素的浓度（C）对其峰面积（A）做回归，得回归方程为C=2.779×10-5A 0.236（r=0.9999，n=6），结果表明鬼臼毒素在24.8~99.2 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.3 精密度试验 制备低、中、高三个不同浓度的鬼臼毒素（24.8、49.6、99.2μg·mL-1）样品，于同一日内和6日内分别测定含量各6次，计算日内和日间精密度，结果日内RSD分别为0.90，0.82，0.65%，日间RSD分别为1.03，0.88，0.76%。
2.4 回收率试验 精密量取已知含量的鬼臼毒素样品适量，分别精密加入低、中、高三个不同量的鬼臼毒素对照液，按上述色谱条件进行色谱分析，分别测定含量各6次，以实测值与理论值之比计算方法回收率，结果见表1。
表1 鬼臼毒素分析方法回收率试验（n=6，`x±s）
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加入量 测的量 回收率 `x RDS
（μg·mL-1） （μg·mL-1） （%） （%） （%） |
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24.8 24.65 99.40±1.04
37.2 36.64 98.49±0.81 98.51 0.89
49.6 48.95 97.65±0.95 |
2.5 重现性试验 取同一批号样品，按样品测定项下方法测定5次，其RSD结果为1.02%。
2.6 样品的含量测定 鬼臼毒素对照品溶液制备：精密称取鬼臼毒素对照品5mg，置100mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为50μg·mL-1对照品溶液。供试品溶液制备：精密量取疣克酊酊剂1mL，置100mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各50μL，注入液相色谱仪，按前述色谱条件，以峰面积按外标法测定含量。3批自制样品测定结果见表2。
表2 制剂中鬼臼毒素含量测定结果（n=3）
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批号 标示量 RSD
（%） （%） |
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010508 102.00 0.85
疣克酊剂 010509 101.46 1.21
010510 100.39 1.05 |
3.讨论
3.1检测波长的选择 用二极管阵列检测器分析比较了鬼臼毒素对照品及样品溶液在190~380nm间的紫外吸收光谱，结果表明在本实验条件下，鬼臼毒素在285nm处有最大吸收峰，故选择285nm为检测波长。
3.2 流动相及色谱柱的确定 本实验考察了不同色谱柱及不同甲醇含量（10%~80%）下，鬼臼毒素与杂质间的分离度。结果表明，选用Hypersil C18（4.6×150mm，5μm）柱，鬼臼毒素与杂质间不能完全分离，选择Discovery C18（4.6×250mm，5μm）柱，可达完全基线分离。同时甲醇比例的增减也直接影响着制剂中样品的分离度，随着甲醇比例的减少，鬼臼毒素与杂质间分离度逐渐增大，但分离时间也相应延长。当甲醇含量为50%时即可达完全分离，此时鬼臼毒素保留时间相对较短，分析时间可控制在25min以内。
3.3 文献报道的方法中，样品的预处理过程较为复杂，导致操作中的误差较大，而且灵敏度较低。本文采用RP-HPLC法测定鬼臼毒素含量，其操作准确简便、灵敏度高、重现性好，有利于药品质量的控制，确保药物的临床疗效。
参考文献：
[1] 王丽平,叶海燕,郁人海. 八角莲注射液的比色测定[J]. 上海第二医科大学学报,1990, 10（4）：341.
[2] Vincent D, Segonzac G. Ann Plam. Franc,1965, 23（1）：53.
[3] 贾忠建,杜牧,王梦林. 薄层扫描法测定桃儿七鬼臼毒素含量[J].中草药, 1988,19（7）：13.
[4] 尚明英,徐国钧,徐铬珊,等. HPLC法测定鬼臼类生药中鬼臼木脂素的含量[J].中国药科大学学报,1996,27（4）：219-222.
[5] 俞培忠,姚莉韵,王丽平. HPLC法分离和测定山荷叶中的鬼臼毒素[J].药物分析杂志,1999,19(1)：35-37.
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