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毛细管电色谱( capillary electro chromatography,简称CEC)是在毛细管电泳(CE )技术不断发展和高效液相色谱(HPLC )理论日益完善的基础上发展起来的一种具有CE和HPLC 双重分离性能的分离分析方法.毛细管电色谱分离是在毛细管两端施加高电压,电渗流驱动流动相经过色谱分离柱,同时,带电溶质基于其质荷比在流动相中迁移,使中性和带电样品中的各组分根据其在色谱固定相和流动相间的吸附,分配平衡常数的差异及本身电泳淌度的差异得以分离.毛细管电色谱不但具有毛细管电泳的高柱效, 还具有高效液相色谱的高选择性; 既可分离带电物质又可分离中性物质,形成了自己独特的高效,微量,快捷的特点,开辟了高效微分离技术的新途径.依照固定相在管内的存在形式,可分为填充柱电色谱(pCEC),开管柱电色谱(OT-CEC)和连续床毛细管电色谱.毛细管电色谱开管柱主要通过涂布,键合和溶胶凝胶等方法在柱内壁制备薄层固定相.开管柱避免了繁琐的颗粒填充过程,也免去了制备塞子所以制备过程简单,并且毛细管电色谱开管柱在生物样品的分离,手性体的拆分等方面获得了应用.
二,实验部分
2.1 仪器和试剂
毛细管电泳系统;150cm石英毛细管;电热鼓风干燥箱;超声波;PH计;
氢氧化钠,盐酸,甲醇,十八烷基三甲氧基硅烷(C18-TMOS),无水甲苯,磷酸氢二钠,磷酸
2.2 开管柱的制备
2.2.1毛细管的预处理
毛细管依次用1mol/L氢氧化钠,二次蒸馏水,1mol/L盐酸,二次蒸馏水,依次各冲洗2h,再接入气相色谱炉中,在110℃通氮气干燥6h.
2.2.2 键合液的制备
称取1g十八烷基三甲氧基硅烷(C18-TMOS)和无水甲苯(预先经过干燥处理)4g充分混合后,转移到注射器中,并用生料带缠好,防止塑料被甲苯腐蚀.
2.2.3 毛细管的键合
通过压力把键合液引入预处理过的毛细管中, 30min后,两端用硅橡胶封口, 再将毛细管置入干燥箱中,于120℃反应10h.冷却后取出,截掉封口段.
2.2.4毛细管的二次键合和后处理
制备好的OT-CEC柱,运行前依次用无水甲苯,甲醇冲洗2h.截取50cm,剩余段再通入键合液,同上步,烘箱中反应10h后取出,同样处理.
2.3 流动相的制备
分别配制甲醇含量为30%,40%,50% ,60%,70%和PH为6,7,8,9的流动相.用磷酸氢二钠和磷酸调节PH,作为缓冲溶液,浓度为10mmol/L.
具体方法是:量取所需量的甲醇,并称一定量的磷酸氢二钠,加水到48ml,滴加磷酸用PH计调节到所需PH值,然后定容到50ml.
2.4 电色谱实验
把制备好的开管毛细管电色谱柱去除约2mm的毛细管外壁高聚物涂层作为检测窗,接入电泳仪.实验前用缓冲液平衡毛细管柱2小时,并加压平衡30min.所用的缓冲液使用前都要经过超声波脱气5min.
先用硫脲,虹吸进样2s,电压为20kV.(附图1)
然后依次进甲苯,萘,联苯,蒽的单一样,记录出峰的时间.(附图3)
最后进混合样.
图1:70%
图2: 50%
图3:30%
三 ,结果与讨论
3.1 分离时间
3.1.1 电压 分离时间随电压增大而变短.实验开始电压为18KV,分离时间过长.将其调为20KV后,分离时间变短.
3.1.2 PH值 将PH值适度增大,分离时间变短.毛细管内表面为硅羟基,硅羟基的等电点为PH=1.5左右,若流动相PH值大于其等电点,则硅羟基电离,毛细管内表面带负电荷.PH增大,将有更多的十八烷基三甲氧基硅烷水解,从而使固定相对样品作用力减小,分离时间变短.
3.1.3 甲醇的浓度 随着甲醇浓度的减小,分离时间变短.由于流动相极性随甲醇浓度增大而减小,因此甲醇的存在会使分离时间变短.然而另一方面,甲醇抑制了硅羟基的电离,从而使毛细管表面电荷减少,进而减小了电渗流,使分离时间变长.后者的影响要大些,因此甲醇浓度对分离时间的影响整体表现为随着甲醇浓度的减小,分离时间变短.
3.2 分离度
3.2.1 PH值 PH增大,将有更多的十八烷基三甲氧基硅烷水解,从而使固定相对样品作用力减小,从而使分离度减小.
3.2.2 甲醇浓度 理论上,甲醇浓度越高 ,分离效果越好.因为当分离非极性混合样时,流动相极性越小,与样品间作用力越强,从而分离效果好.但是实验中发现,甲醇浓度太大却分不开,当使用30%甲醇的时候,分离效果很好.可能是因为甲醇抑制了硅羟基的电离,从而使毛细管表面电荷减少,致使分离效果变差.
3.3 前处理
毛细管依次用1mol/L氢氧化钠,二次蒸馏水,1mol/L盐酸,二次蒸馏水冲洗.作用是清洁毛细管内表面. 制备好的OT-CEC柱,运行前依次用无水甲苯,甲醇冲洗2h.用无水甲苯洗是为了冲掉未反应的十八烷基三甲氧基硅烷,而用甲醇洗是为了冲掉甲苯.
毛细管键合过程中要注重检查毛细管是否被堵住,假如堵住,需重新开始实验.
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